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木质素过氧化物酶（Linin peroxidase ，Lip）试剂盒说明书

微量法

注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义

木质素过氧化物酶（EC1.11.1.14）是一种含亚铁血红素的过氧化物酶，属于木质素降解酶系，在木质素生物降解、造纸工业、纺织工业、芳香化合物转化与降解及环境污染控制等方面具有较大的应用潜力。

测定原理

木质素过氧化物酶氧化藜芦醇生成藜芦醛，在 310nm 处有特征吸收峰。

自备实验用品及仪器

天平、研钵、低温离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板（UV 板）。

试剂组成和配制

试剂一：液体 115mL×1 瓶，4℃保存。

试剂二：液体 4mL×1 瓶，4℃避光保存。

试剂叁：液体 2mL×1 支，4℃保存。

酶液提取

1. 组织：按照质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g，加入1mL试剂一）加入试剂一，冰浴匀浆后于 4℃，10000g 离心10min，取上清置于冰上待测。

2. 细胞：按照细胞数量（10⁴个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后 4℃，10000g 离心10min，取上清置于冰上待测。

3. 培养液或其它液体：直接检测。

测定操作

酶活计算公式

a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1．按照蛋白浓度计算

酶活性定义：每毫克蛋白每分钟氧化1nmol藜芦醇所需的酶量为一个酶活力单位。

LiP 活性（nmol/min/mg prot）=△础÷（ε×诲）×V反总÷（V样×Cpr）÷T= 215×△A÷Cpr

2．按照样本质量计算

酶活性定义：每克样品每分钟氧化1nmol藜芦醇所需的酶量为一个酶活力单位。

LiP 活性（nmol/min/g）=△础÷（ε×诲）×V反总÷（V样×W÷V样总）÷T= 215×△A÷W

3．按照细胞数量计算

酶活性定义：每10⁴个细胞每分钟氧化1nmol藜芦醇所需的酶量为一个酶活力单位。

LiP 活性（nmol/min/10⁴cell）=△础÷（ε×诲）×V 反总÷（V 样×细胞数量÷V 样总）÷T

= 215×△A÷细胞数量

4．按照液体体积计算

酶活性定义：每升培养液每分钟氧化1nmol藜芦醇所需的酶量为一个酶活力单位。

LiP 活性（nmol/min/L）=△础÷（ε×诲）×V 反总÷V 样÷T= 2.15×10⁵×△A

ε：藜芦醛摩尔消光系数：9300L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 反总：反应总体积，1mL；

V 样：反应中样本体积，0.1mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；T：反应时间，5min

b. 用 96 孔板测定的计算公式如下

1．按照蛋白浓度计算

酶活性定义：每毫克蛋白每分钟氧化1nmol藜芦醇所需的酶量为一个酶活力单位（U）。

LiP 活性（U/mg prot）=△础÷（ε×诲）×V 反总÷（V 样×Cpr）÷T= 430×△A÷Cpr

2．按照样本质量计算

酶活性定义：每克样品每分钟氧化1nmol藜芦醇所需的酶量为一个酶活力单位（U）。

LiP 活性（U/g）=△础÷（ε×诲）×V 反总÷（V 样×W÷V 样总）÷T= 430×△A÷W

3．按照细胞数量计算

酶活性定义：每10⁴个细胞每分钟氧化1nmol藜芦醇所需的酶量为一个酶活力单位（U）。

LiP 活性（U/10⁴cell）=△础÷（ε×诲）×V 反总÷（V 样×细胞数量÷V 样总）÷T

= 430×△A÷细胞数量

4．按照液体体积计算

酶活性定义：每升培养液每分钟氧化1nmol藜芦醇所需的酶量为一个酶活力单位（U）。

LiP 活性（U/L）=△础÷（ε×诲）×V 反总÷V 样÷T= 4.3×10⁵×△A

ε：藜芦醛摩尔消光系数：9300L/mol/cm；d：比色皿光径，0.5cm；V 反总：反应总体积，

1mL；V 样：反应中样本体积，0.1mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓

度，mg/mL；W：样本质量，g；T：反应时间，5min